基因編輯是近年來發(fā)展起來的可以對基因組完成精確修飾的一種技術，可完成基因定點InDel突變、敲入、多位點同時突變和小片段的刪失等。與傳統(tǒng)的TALEN和ZFN技術相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)更便捷、高效，應用也更廣泛，目前該技術成功應用于人類細胞、斑馬魚、小鼠以及細菌的基因組精確修飾。然而，基因編輯仍然是非常新穎的技術。

　　近日，生物谷圍繞基因編輯研究及亮點技術CRISPR特別采訪了來自北京生命科學研究所的張昱博士，張昱在基因編輯領域有多年科研經驗，對基因編輯及癌癥關系研究認識深刻。張博士還將在9月26日出席由生物谷主辦的“2014基因編輯研討會”并發(fā)表重要報告，屆時他將為我們帶來更多精彩解讀。以下為本次訪談實錄。

　　生物谷：能否簡要說明基因編輯的原理、應用領域及研究意義？

　　張昱：遺傳物質是一切生命活動的物質基礎。通過對生物體基因組的改變（基因編輯），從而改變遺傳物質及其所編碼信息的內容或讀取，將會影響生物體的遺傳和其他生物性狀。這些生物包括低等生物，比如細菌等微生物；高等生物，比如與人類密切相關的動物和植物；最終也包括人類。

　　可以想象，改變微生物的基因從而可以影響其各種性狀，比如影響其耐藥性，發(fā)酵特性等等；基因編輯可以用于改變農業(yè)生產中動物和植物的性狀，比如產量，繁殖等；對人類基因組的編輯的應用由于倫理等原因，現(xiàn)在主要集中在基因修復方面，即把一些遺傳疾病中出現(xiàn)基因突變回復到正常，但隨著對人類疾病的深入研究，基因編輯的方案和目標會進一步擴大。顯而易見，改變生命的遺傳信息不僅是一個哲學理論問題，也有著廣泛的實踐意義。

　　生物谷：基因編輯涉及哪些技術？其中，新技術CRISPR與傳統(tǒng)技術相比擁有哪些優(yōu)勢？

　　張昱：上世紀末基因工程技術的快速發(fā)展使得基因編輯在微生物尤其是細菌和單細胞真核生物（比如酵母）中成為可能，但對于多細胞生物，尤其哺乳動物基因組的編輯一直由于技術問題進展比較緩慢。一般來說，基因編輯的目的是在基因組的特定位點實現(xiàn)可控的改變：比如刪除一段基因的編碼或調控序列，從而不能產生有功能的基因轉錄產物，過去通稱為“基因敲除”；或者用一段外源性或改變的序列代替原有基因序列，通稱為“基因敲入”。傳統(tǒng)的真核生物中準確基因編輯倚賴同源重組，對于模式動物（比如小鼠），研究發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞中發(fā)生同源重組的頻率比體細胞中高，從而可以在其中進行基因編輯，進而利用干細胞的特性產生基因編輯的小鼠，這一技術獲得了2007年的諾貝爾獎。

　　為了能在體細胞和多種生物中實現(xiàn)基因編輯，大量的工作集中在如何提高基因編輯效率，尤其是同源重組效率上。一方面，研究發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化同源重組的靶向供體可以提高同源重組效率。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)在靶向區(qū)域引入DNA雙鏈斷裂也能夠大幅度提高重組效率。事實上，這并不奇怪，因為同源重組修復是真核生物中DNA雙鏈斷裂的主要修復方式之一（另一主要修復方式是同源模版不依賴的非同源性末端連接）。如果在基因組特異區(qū)域引入一個DNA雙鏈斷裂，但不提供同源重組的靶向供體時，細胞可以利用同源染色體進行同源重組修復，也可以利用非同源性末端連接直接修復。但后者的修復過程中通常伴有連接處的堿基缺失或插入，因此也可以造成突變。同樣，非同源性末端連接也可以把兩個分開的DNA雙鏈斷裂連接在一起，從而造成兩個DNA雙鏈斷裂之間基因片段的刪除；當這兩個DNA雙鏈斷裂位于不同的非同源染色體上時，將會造成染色體轉位。

　　最近基因編輯技術的突破主要集中在利用位點特異性DNA斷裂來提高編輯的效率上。在CRISPR之前，已經發(fā)展了三代基因組特異剪切的技術，這些技術方案的核心是如何實現(xiàn)對基因組特定序列的特異和高效識別、結合、和剪切。與第一代利用改造識別長DNA序列（12-40nt）的限制性內切酶，第二代利用蛋白質鋅指結構的DNA結合特異性，第三代利用TALEN蛋白的DNA特異結構域相比，CRISPR對DNA序列的特異結合利用了CRISPER復合物中guideRNA與靶序列的互補堿基配對，而不是蛋白質結構域與DNA的結合，同時對靶DNA的剪切活性來自CRISPR蛋白內的兩個核酸酶活性域，所以可以說CRISPR是一種全新的基因組剪切技術。同時，與以往傳統(tǒng)技術相比，它具有高特異性，設計上更多的自由度，更高的剪切效率，同時可以被較為方便地導入細胞。CRISPR技術僅僅在最近的兩年開始被大量深入研究和優(yōu)化，可以預見，隨著更深入的機制和應用研究，這一技術的優(yōu)勢會越來越大。

　　生物谷：CRISPR技術在疾病治療領域取得了哪些進展？

　　張昱：基因編輯對人類疾病治療的研究大部分還處在實驗室和動物模型階段，主要有兩個方面。首先，對一些由已知單基因突變產生的遺傳疾病，可以把這些突變替換掉，從而恢復基因的功能。當然，這一基因編輯需要發(fā)生在成體干細胞中，從而編輯后的細胞可以增殖進而取代原有缺陷的體細胞。目前，對于一些血液系統(tǒng)的遺傳疾病研究，比如地中海貧血癥、嚴重免疫缺陷等，已經在動物模型上取得了很大的進展。其次，研究發(fā)現(xiàn)對某些基因的失活可以預防或治療特異疾病。比如，T細胞上的HIV共受體CCR5發(fā)生突變后將不能被HIV感染，已經有臨床實驗利用鋅指酶對HIV病人T細胞的CCR5失活，再把這些細胞重新導回病人，使用CRISPR的類似臨床實驗預期會被很快開展。臨床和實驗室中大量使用抑制劑來抑制蛋白的活性，可以預見基因編輯導致的基因失活將會代替一部分抑制劑。

　　生物谷：基因編輯研究存在哪些技術難點？

　　張昱：基因編輯研究的主要技術難點是如何高效地在體內和體外實現(xiàn)準確的編輯。對基因組的剪切意味著對基因組引入DNA損傷，如何避免這些DNA損傷導致有害的和不期待的基因組不穩(wěn)定，比如基因突變和染色體轉位等，越來越多地得到重視。同時，如何降低剪切的脫靶效應（off－target）是實現(xiàn)準確基因編輯面臨的迫切問題，對于基因組修飾和剪切的機制進一步研究將提供優(yōu)化的思路。利用基因編輯治療人類疾病時，盡管發(fā)生基因編輯的頻率已經相當地高，一個技術難點是如何分離出發(fā)生了正確編輯的細胞。

　　生物谷：相比轉基因技術產物，基因編輯產品是不是更容易受社會認可？市場上目前有沒有應用基因編輯技術的成功案例推出？

　　張昱：轉基因的一個主要問題是它在生物體中過表達了一個外源性的基因，在倫理上有較大的爭議?；蚓庉嬋绻皇菍仍椿虻墓δ苓M行調控，理論上這一調控是自然存在的。尤其是把突變的基因進行修復而回復正常功能，倫理上應該更容易被社會接受。目前市場上應該還沒有應用基因編輯的動物產品，但預期應用基因編輯的植物產品應該會很快出現(xiàn)。

　　生物谷：考慮到安全因素，基因編輯技術從實驗室進入市場還要多久？面臨的主要風險是什么？

　　張昱：基因編輯的應用主要面臨的問題不僅僅是技術層面的，而更大一部分來自倫理方面，尤其是對于人類為應用對象，面臨和干細胞相似的問題。另一方面，基因編輯對生物體性狀的可能不良影響也需要進行長期的和系統(tǒng)的研究。